2022年5月2日，陸道培醫(yī)院陸佩華教授（第一作者和共同通訊作者）團(tuán)隊、河北森朗生物科技有限公司（以下簡稱“森朗”）李建強(qiáng)教授（共同通訊作者）團(tuán)隊（劉瑩，共同第一作者）、北京大學(xué)人民醫(yī)院黃曉軍教授（共同通訊作者）合作在血液科國際期刊Blood（IF=23.63）發(fā)表了題為Naturally Selected CD7 CAR-T Therapy without Genetic Manipulations for T-ALL/LBL: First-in-human Phase I Clinical Trial 的研究論文。
急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL) 和T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤(T-cell lymphoblastic lymphoma, T-LBL)是具有高度侵襲性的T系惡性腫瘤。由于正常T細(xì)胞和惡性T細(xì)胞之間共有的抗原性，目前仍然缺乏針對T細(xì)胞惡性腫瘤的獲批CAR-T療法。
CD7在T-ALL/LBL T細(xì)胞表面高度表達(dá)，是潛在的CAR-T治療靶點。靶向CD7的免疫療法可能會受到T細(xì)胞自相殘殺機(jī)制（fratricide）的影響。因此，在既往研究中曾采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和蛋白沉默表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)靶向CD7的CAR-T細(xì)胞。但是，基因編輯技術(shù)會使得CD7 CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)成本增加。此外，使用患者自體T細(xì)胞制造CD7 CAR-T細(xì)胞仍然具有一定難度。雖然供者來源或通用型CD7 CAR-T是一種選擇，但尋找合適的供體、異體CAR-T在體內(nèi)擴(kuò)增能力及持續(xù)時間等問題仍有待解決。
針對上述難題，本研究開展探索，使用了森朗生物研發(fā)的患者或供者來源的，無需額外進(jìn)行CD7基因編輯或蛋白質(zhì)表達(dá)阻斷的“自然選擇（Naturally Selected）”CD7 CAR-T細(xì)胞(NS7CAR)的新產(chǎn)品，并在1項針對T-ALL/LBL患者的1期臨床試驗中首次探索了NS7CAR療法在人體內(nèi)的安全性和有效性。
臨床前研究
研究者使用三種不同的方法制造了靶向CD7的CAR-T細(xì)胞并比較它們的功能：1)NS7CAR：通過用7CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)總T細(xì)胞，然后對其進(jìn)行“自然選擇”的細(xì)胞培養(yǎng)方式獲得；2)Neg7CAR：由天然存在的CD7陰性T細(xì)胞（占CD3+T細(xì)胞的3%-10%）用7CAR進(jìn)行純化和轉(zhuǎn)導(dǎo)后進(jìn)行生產(chǎn)；3)KO7CAR：通過將7CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)到使用CRISPR/Cas9RNP敲除CD7基因的總T細(xì)胞進(jìn)行制造。
在2周的培養(yǎng)期間內(nèi)，NS7CAR的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)顯著低于Neg7CAR和KO7CAR的擴(kuò)增倍數(shù)；然而，有87.3%的NS7CAR是活細(xì)胞，使得進(jìn)一步研究成為可能。在收獲時，NS7CAR組中平均92.4%的T細(xì)胞表達(dá)7CAR分子，顯著高于Neg7CAR或KO7CAR（p<0.0001)。在7CAR慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)三天后，NS7CAR組中的T細(xì)胞發(fā)生了從CD7+CAR-到CD7-CAR+的快速而顯著的表型轉(zhuǎn)變。
一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，盡管NS7CAR組中的T細(xì)胞在體外培養(yǎng)后用流式未檢測到CD7的表面表達(dá)，但使用RT-PCR和WesternBlot檢測到了顯著的CD7mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。與此同時，在Neg7CAR或KO7CAR細(xì)胞中未觀察到CD7mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)。這些結(jié)果表明，盡管NS7CAR表達(dá)CD7mRNA和蛋白質(zhì)，但它們在免疫學(xué)上是CD7陰性的，并由于CD7CAR的抗原隱蔽/細(xì)胞內(nèi)隔離作用而逃脫了自相殘殺的細(xì)胞殺傷機(jī)制。這一點在隨后的臨床研究中，在CAR-T回輸后第28天檢測到患者體內(nèi)NS7CAR中CD7mRNA的表達(dá)持續(xù)存在而被進(jìn)一步證實。此外，相比Neg7CAR和KO7CAR，NS7CAR包含較多的CD8+亞群和中央記憶表型亞群。
在體外抗白血病實驗中，NS7CAR和KO7CAR對CCRF-CEM細(xì)胞均表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，并釋放高水平的IFN-γ和TNF-α，但Neg7CAR細(xì)胞的相應(yīng)數(shù)值較低。在動物實驗中，在CAR-T注射后的前兩周內(nèi)，NS7CAR和KO7CAR均可顯著降低小鼠模型中的白血病負(fù)擔(dān)。這些數(shù)據(jù)證明了無需額外的基因編輯，直接由7CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的總T細(xì)胞產(chǎn)生有效的CD7CAR-T的可行性。因此，陸道培醫(yī)療團(tuán)隊在1期臨床試驗中使用NS7CAR-T細(xì)胞，進(jìn)一步探索其有效性和安全性。
臨床研究
‖研究設(shè)計
本研究是1項開放、單臂的1期臨床研究，目的是評估NS7CAR對CD7+R/R T-ALL或T-LBL患者的安全性和療效。入組標(biāo)準(zhǔn)包括年齡在2至65歲之間的患者，既往至少接受過兩線治療后失敗，且CD7表達(dá)≥80%的患者。在NS7CAR輸注后的第28天后，根據(jù)醫(yī)生的考量和患者的意愿，允許進(jìn)行鞏固性異體造血干細(xì)胞移植。
‖患者基線數(shù)據(jù)
此次臨床試驗，共入組和回輸20名復(fù)發(fā)或難治性(R/R) T-ALL/T-LBL患者，其中包含14名R/R T-ALL患者及6名R/R T-LBL患者。3名患者為Ph陽性或ETP-ALL高危亞型；11名患者存在高危突變或基因融合。5名患者在入組前接受過移植。患者接受了中位數(shù)為4.5線的治療。入組時，17名患者的骨髓腫瘤細(xì)胞比例中位數(shù)為21.49%；有3名T-LBL患者髓內(nèi)未見腫瘤細(xì)胞。分別有5位T-LBL和4位T-ALL患者有髓外病灶，其中3名有中樞受累。
‖臨床產(chǎn)品制備及回輸
研究應(yīng)用了來源于患者或其移植供者的NS7CAR產(chǎn)品。對于未接受過異基因移植的患者，使用自體CAR-T細(xì)胞；對于入組時為移植后復(fù)發(fā)狀態(tài)的患者，在對患者進(jìn)行綜合評估后確定使用患者自體或移植供者來源的CAR-T細(xì)胞。所有患者的NS7CAR產(chǎn)品均成功制備（自體來源，n=18；供者來源，n=2），中位轉(zhuǎn)染效率為95.10%。NS7CAR產(chǎn)品有更多的CD8+亞群，中位CD4/CD8比例為0.42。在Day0，分別3、16和1名患者接受了低劑量（0.5×106/kg）、中劑量（1-1.5×106/kg）或高劑量（2×106/kg）的單次NS7CAR回輸。
‖療效及安全性
NS7CAR展現(xiàn)出了良好的安全性和耐受性。1名患者未出現(xiàn)CRS;18名患者的CRS≤2級，僅有一名患者出現(xiàn)3級CRS。2名患者發(fā)生1級ICANS。
同時，NS7CAR在臨床試驗中展現(xiàn)了令人振奮的好療效。在Day28時，16/17（94.12%）的骨髓受累患者實現(xiàn)了MRD陰性完全緩解；3名僅有髓外病灶的T-LBL患者也繼續(xù)保持了髓內(nèi)CRi的狀態(tài)。在9名有髓外病灶的患者中，5名在中位時間29天時達(dá)到髓外CR。兩名有巨大縱隔腫物（>7cm）的患者在第29天分別達(dá)到髓外部分緩解（PR）和疾病穩(wěn)定（SD），其中PR患者在第104天時，其髓外病灶進(jìn)一步縮小。兩名有中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤的患者也分別在第15天和第28天達(dá)到CR。
至研究截止日期（2021年10月25日），患者的中位隨訪時間為142.5天，最長達(dá)311天。6/20名患者在CAR-T細(xì)胞回輸后未接受額外的抗白血病治療或移植，其中4人在54天的中位時間保持無疾病進(jìn)展。在回輸后中位時間57.5天，10名CR患者接受了鞏固性橋接移植；移植后中位隨訪時間為210天，7/10名CR患者在移植后保持MRD陰性并持續(xù)生存。兩名患者因個人原因出組，出組時均處于CR。一名患者進(jìn)行了二次移植，發(fā)展為3級aGvHD，隨后去世。有4名未達(dá)到CR或CR后復(fù)發(fā)的患者接受了挽救性移植并全部達(dá)到CR。
‖NS7CAR的細(xì)胞動力學(xué)
NS7CAR擴(kuò)增起始于回輸后中位數(shù)4.5天。CAR中位峰值拷貝數(shù)為1.37×105copies/μg DNA，達(dá)到峰值的中位時間為19天。在末次隨訪時，NS7CAR+DNA中位持續(xù)時間為90天；在移植后中位時間39.5天，12/14名患者仍可通過qPCR檢測到水平較低的NS7CAR+DNA。對于未橋接移植的6名患者，CAR-T細(xì)胞在末次隨訪中仍可檢測到，中位持續(xù)時間為48.5天。用流式檢測的NS7CAR中位峰值比例為67.76%，最高比例達(dá)84.71%；中位峰值時間為17天。
NS7CAR回輸后，患者外周血中惡性和正常CD7+細(xì)胞的最顯著減少發(fā)生在回輸后中位時間第7天。在CAR-T擴(kuò)增高峰，每位患者的T/B/NK細(xì)胞（不包括CAR+ 和白血病T細(xì)胞）的絕對數(shù)量均顯示出不同程度的短暫下降。NS7CAR迅速消滅了CD7+細(xì)胞，并主要保留了CD7陰性細(xì)胞亞群。T/B/NK細(xì)胞隨后恢復(fù)到基線水平，但就如所預(yù)期的，在移植后不久出現(xiàn)下降。在移植后，正常的CD7+T細(xì)胞和NK細(xì)胞得到充分恢復(fù)。
‖總結(jié)
該研究揭示了通過“自然選擇”機(jī)制生產(chǎn)靶向CD7 CAR-T細(xì)胞的方法(NS7CAR)。研究者發(fā)現(xiàn)，雖然流式無法檢測到NS7CAR-T細(xì)胞表面上的CD7分子，但NS7CAR-T細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)CD7mRNA和蛋白質(zhì)的水平雖然稍低，但與正常對照T細(xì)胞中的水平是可比的。研究認(rèn)為，NS7CAR-T細(xì)胞的CD7分子很可能被CD7CAR抗原掩蓋或在胞內(nèi)隔離，大大減少了NS7CAR-T的表面CD7抗原，避免了CAR-T細(xì)胞之間的大量自相殘殺。不能排除在體外“自然選擇”過程中，少部分NS7CAR-T細(xì)胞從自相殘殺中出現(xiàn)的可能性。這使得NS7CAR-T與真正的CD7陰性的Neg7CAR-T或KO7CAR-T細(xì)胞形成對比。研究者提出，許多NS7CAR-T細(xì)胞本身并不是CD7陰性，而是功能性CD7陰性。
因此，研究者提出假設(shè)：由于CAR信號可能需要蛋白質(zhì)復(fù)合物形成，CAR-T細(xì)胞通過NS7CAR-T細(xì)胞表面的游離CD7CAR與靶向T細(xì)胞上表達(dá)的CD7之間的相互作用被激活，而胞內(nèi)CD7-CD7CAR復(fù)合物不能激活T細(xì)胞。與Neg7CAR和KO7CAR細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)CD7CAR-CD7相互作用是否導(dǎo)致CAR信號減弱,并導(dǎo)致NS7CAR細(xì)胞體外擴(kuò)增程度降低仍待確定。其次，自相殘殺是否在NS7CAR減少擴(kuò)增中發(fā)揮了作用還有待進(jìn)一步研究。
在NS7CAR中，存在顯著更多的CD8+中央記憶CAR-T細(xì)胞，這種CD8偏向性可能提供更持久的疾病控制。由于NS7CAR的產(chǎn)生不涉及額外的基因編輯，避免了脫靶效應(yīng)的潛在風(fēng)險。因此，NS7CAR的生物學(xué)特性和其生產(chǎn)的便捷十分有利于其臨床應(yīng)用。
迄今為止，針對T細(xì)胞惡性血液腫瘤的靶向CD7 的CAR-T療法僅有有限的臨床試驗和病例報告。NS7CAR可由患者或供者的外周血制備，中位轉(zhuǎn)染率大于95%，且細(xì)胞活性率約90%。由T系惡性血液腫瘤患者制備的自體CAR-T細(xì)胞的主要安全顧慮是細(xì)胞終產(chǎn)品中的惡性細(xì)胞污染。根據(jù)每個患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表型，使用CD3或CD4/CD8選擇加上NS7CAR的體外 "自然選擇 "以及強(qiáng)大的抗白血病活性，可以成功地排除NS7CAR制備中的惡性細(xì)胞。
在該臨床試驗中，幾乎所有患者在第28天時都達(dá)到了MRD陰性的CR。大部分有髓外病灶的患者，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者或彌漫性髓外受累的患者，也都能達(dá)到髓外CR。兩名有巨大縱膈腫塊的患者分別達(dá)到了PR和SD。對于有巨大腫塊的患者來說，可能需要更長的時間及聯(lián)合治療來實現(xiàn)CR，因為根據(jù)PET-CT評估，處于PR的患者在第104天發(fā)現(xiàn)有進(jìn)一步的臨床改善。
入組該臨床試驗的患者曾接受了大量的既往治療。鑒于CD19 CAR-T治療的B-ALL患者復(fù)發(fā)率較高，而且T-ALL/LBL比一般B-ALL更具侵略性，該研究允許在緩解后進(jìn)行鞏固性異基因造血干細(xì)胞移植。共有10名骨髓和髓外CR患者進(jìn)行了鞏固性異基因造血干細(xì)胞移植，這可能限制對于NS7CAR-T單藥治療的持續(xù)性的評估。盡管如此，在中位隨訪時間超過4.5個月（最長10個月）的情況下，NS7CAR回輸后再進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植組沒有觀察到復(fù)發(fā)現(xiàn)象。在6名沒有接受移植的CR患者中，有4名在最后一次隨訪時仍保持CR（中位時間1.5個月，最長6個月）。然而，在一些未達(dá)到CR或復(fù)發(fā)的患者中，觀察到CD7靶點丟失。
STIL-TAL1融合基因與較高的復(fù)發(fā)率和較差的預(yù)后有關(guān)，發(fā)生在高達(dá)約25%的T-ALL患者中。在這一研究中，所有3名STIL-TAL1融合基因的患者預(yù)后都較差，有1名NR和2名早期復(fù)發(fā)，表明單獨(dú)使用CAR-T療法可能無法扭轉(zhuǎn)其臨床結(jié)局。一旦這類患者從CAR-T中獲得CR，應(yīng)在治療過程的早期考慮進(jìn)行移植。
NS7CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增在中位第19天達(dá)到峰值，截至最后一次隨訪時，可檢測到NS7CAR-T細(xì)胞持續(xù)存在長達(dá)195天。12/14名患者在移植后中位隨訪時間1.2個月（最長4.9個月）時，仍可通過qPCR檢測到低水平的NS7CAR-T。
NS7CAR表現(xiàn)出卓越的安全性，在大多數(shù)患者中只有輕微的CRS，沒有嚴(yán)重的神經(jīng)毒性。在該臨床研究方案中，早期應(yīng)用托珠單抗干預(yù)管理，有可能降低嚴(yán)重CRS的發(fā)生。這種早期干預(yù)和管理可能在減少CRS方面發(fā)揮了作用。
兩名曾有異基因造血干細(xì)胞移植史的患者在回輸時使用了來自移植供者的CAR-T細(xì)胞，其中一位出現(xiàn)了輕微的皮膚排異反應(yīng)。因此，應(yīng)特別關(guān)注此類患者。14名患者中有7名接受了后續(xù)的異基因造血干細(xì)胞移植，包括其中2名第二次移植的患者出現(xiàn)了GvHD。雖然在這7名回輸后出現(xiàn)GvHD的患者中仍可檢測到極低水平的CAR-T細(xì)胞，但是不太可能是導(dǎo)致GvHD的原因。
小結(jié)
在該研究中，NS7CAR在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤作用。NS7CAR的首次人體臨床試驗表明，無需額外的基因編輯即可防止CD7表達(dá)，并成功生產(chǎn)NS7CAR-T細(xì)胞?？傮w而言，NS7CAR對治療R/R T-ALL/LBL是安全且高效的。
關(guān)于陸道培醫(yī)院
陸道培醫(yī)療集團(tuán)是陸道培院士在本世紀(jì)初創(chuàng)建的一家專注于血液病及腫瘤治療、科研、教學(xué)為一體的民營醫(yī)療集團(tuán)。經(jīng)過十幾年的不懈努力，目前已發(fā)展到四家醫(yī)療機(jī)構(gòu)和一家研究院：河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院、北京陸道培醫(yī)院、北京陸道培血液病醫(yī)院、上海新道培血液病醫(yī)院和陸道培血液病研究院。
陸道培醫(yī)療集團(tuán)擁有病床共計1136張，百級層流無菌病房126間。以陸院士領(lǐng)銜的醫(yī)療團(tuán)隊有三百多人，其中不乏業(yè)內(nèi)翹楚教授級的博士生導(dǎo)師，也有頗有建樹的博士、碩士等年輕才俊。陸道培醫(yī)療集團(tuán)還擁有訓(xùn)練有素的檢測、護(hù)理、營養(yǎng)、康復(fù)、行政、后勤、社會服務(wù)等各類人才隊伍，本著“一切為了患者”的宗旨，時刻準(zhǔn)備著為廣大患者服務(wù)。
陸道培醫(yī)療集團(tuán)是世界上最活躍的造血干細(xì)胞移植中心之一，每年完成的造血干細(xì)胞移植數(shù)量占全國總移植量的10%，每年完成國內(nèi)最多的難治復(fù)發(fā)及挽救性造血干細(xì)胞移植，使得親緣半相同移植取得了與非血緣移植和同胞相合移植相媲美的結(jié)果。2021年移植病例1168例，其中親緣半相同移植843例，占72%以上。血液科始終站在世界醫(yī)學(xué)的前沿，通過對血液病基因特性的探索，加入行之有效的免疫治療、靶向治療技術(shù)，總體提高了血液病患者的治愈率和長期生存率，改善了其生活質(zhì)量。陸道培醫(yī)療團(tuán)隊自2015年7月開展CAR-T臨床試驗項目，療效顯著，安全性高。截止2021年12月，已完成1479例患者入組CAR-T臨床試驗，其優(yōu)異的試驗結(jié)果得到國際血液學(xué)界的認(rèn)可和贊譽(yù)。
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